MUTASI KODON 249 GEN P 53 PADA JARINGAN

HATI NON KANKER

(LAPORAN PENDAHULUAN)

Haris Widita***, Soewignjo Soemohardjo*, Zainul Muttaqin*, Kusumowardoyo**,

Stephanus Gunawan*, dan Wenny Astuti Achwan***

* Unit Riset Biomedik RSU Mataram

** Bagian Patologi Anatomi FK Unair

*** Bagian Penyakit Dalam RSU Mataram

———————————————————————————

ABSTRAK

Pendahuluan

Peran p53 yang merupakan salah satu gen penekan tumor dalam terjadinya Kanker Hati Primer (KHP) sangat penting karena gen tersebut berperan dalam pengaturan pertumbuhan sel dan proses apoptosis. Infeksi virus Hepatitis B dan C keduanya menghambat peran gen p53 tersebut dan sering terjadi mutasi pada gen tersebut. Pada KHP sering terjadi mutasi pada kodon 249 gen p53. Hal ini diduga sebagai salah satu pemicu terjadinya KHP. Mutasi gen p53 dideteksi pada jaringan KHP. Dengan metode SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) mutasi gen p53 hanya didapatkan pada jaringan keganasan dan tidak dapat dideteksi pada jaringan yang belum mengalami keganasan. Tapi dengan menggunakan metode yang lebih canggih seperti ASPCR (Allele-specific polymerase chain reaction) mutasi gen p53 dapat dideteksi lebih dini pada jaringan hati yang belum mengalami keganasan. Sehingga terbuka kemungkinan untuk melakukan deteksi molekuler dini keganasan hati dengan kemungkinan intervensi dini pada kasus-kasus dimana terdapat kemungkinan untuk terjadinya KHP di masa yang akan datang.

Tujuan : Mendeteksi mutasi gen p53 pada jaringan nonkanker dengan metode ASPCR.

Bahan dan Cara : Bahan penelitian ini adalah 18 sediaan biopsi hati yang terdiri dari: 11 orang penderita Hepatitis B Kronik, 2 orang penderita Hepatitis C Kronik, 1 orang penderita Hepatitis B dan C Kronik, 1 orang penderita sirosis aktif tipe B, 2 orang penderita Fatty Liver dan 1 orang penderita dengan ikterus obstruktif ekstrahepatik. Biopsi dilakukan dengan metode aspirasi menggunakan jarum Hepafix. Jaringan hati difixasi dengan formalin 10%. Kemudian dilakukan pengecatan H&E untuk diagnosa histologik. Pemeriksaan ASPCR dilakukan pada bahan biopsi segar pada 9 penderita dan pada 9 penderita lain dari blok parafin.

Hasil : Mutasi kodon 249 p53 didapatkan pada 5 orang (27.78%) yang terdiri dari : 3 orang penderita Hepatitis B Kronik, 1 orang penderita Hepatitis C Kronik, 1 orang penderita dengan Hepatitis B dan C Kronik.

Kesimpulan : Mutasi gen p53 dapat terjadi pada jaringan hati penderita-penderita penyakit hati kronik yang belum menunjukkan adanya tanda-tanda KHP. Cara ini membuka kemungkinan untuk diagnosa dini KHP dan sehingga memungkinkan intervensi dini untuk mencegah terjadinya KHP.

Kata Kunci : mutasi gen p53, jaringan hati non kanker.

————————————————————————————————————

PENDAHULUAN

Peran p53 yang merupakan salah satu gen penekan tumor dalam terjadinya Kanker Hati Primer (KHP) sangat penting karena gen tersebut berperan dalam pengaturan pertumbuhan sel dan proses apoptosis. Infeksi virus Hepatitis B dan C keduanya menghambat peran gen p53 tersebut dan sering terjadi mutasi pada gen tersebut. Pada KHP sering terjadi mutasi pada kodon 249 gen p53.(1) Hal ini diduga sebagai salah satu pemicu terjadinya KHP.(2) Mutasi gen p53 dideteksi pada jaringan KHP. Dengan metode SSCP (Single-stranded conformational polymorphism) mutasi gen p53 hanya didapatkan pada jaringan keganasan dan tidak dapat dideteksi pada jaringan yang belum mengalami keganasan. Tapi dengan menggunakan metode yang lebih canggih seperti ASPCR (Allele-specific polymerase chain reaction) mutasi gen p53 dapat dideteksi lebih dini pada jaringan hati yang belum mengalami keganasan.(3) Sehingga terbuka kemungkinan untuk melakukan deteksi molekuler dini keganasan hati dengan kemungkinan intervensi dini pada kasus-kasus dimana terdapat kemungkinan untuk terjadinya KHP di masa yang akan datang.

TUJUAN : Mendeteksi mutasi gen p53 pada jaringan nonkanker dengan metode ASPCR.

BAHAN DAN CARA : Bahan penelitian ini adalah 18 sediaan biopsi hati yang terdiri dari: 11 orang penderita Hepatitis B Kronik, 2 orang penderita Hepatitis C Kronik, 1 orang penderita Hepatitis B dan C Kronik, 1 orang penderita sirosis aktif tipe B, 2 orang penderita Fatty Liver dan 1 orang penderita dengan ikterus obstruktif ekstrahepatik. Penderita Fatty Liver dan ikterus obstruktif dimasukkan disini sebagai kontrol karena kedua keadaan ini diperkirakan tidak akan menjadi ganas. Biopsi hati dilakukan dengan menggunakan jarum biopsi Hepafix (Braun Melsungen AG, Jerman). Jaringan hati diperiksa oleh seorang ahli patologi senior yang berpengalaman dalam pemeriksaan biopsi hati (K). Analisis histopatologik dilakukan menggunakan sistem klasifikasi METAVIR(4) yang membagi derajat nekroinflamasi menjadi 4 (Grade 0 : tidak ada aktifitas, 1: aktifitas ringan , 2: aktifitas sedang, 3: aktifitas parah) dan derajat fibrosis menjadi 5 (stage 0 : Tidak ada fibrosis, 1 : fibrosis khusus di daerah porta tanpa pembentukan septa , 2 : fibrosis di daerah porta dengan beberapa septa, 3 : fibrosis porta dengan banyak pembentukan septa, 4 : sirosis).(5) Dalam penelitian ini aktifitas nekroinflamasi dan fibrosis dianggap signifikan bila mencapai grade 2 dan stage 2.

Pemeriksaan ASPCR dilakukan pada bahan biopsi segar pada 9 penderita dan pada 9 penderita lain dari blok parafin.

Metode Pemeriksaan ASPCR

Ekstraksi DNA

DNA jaringan hati diekstrak dengan menggunakan larutan TriZol (invitrogen). Untuk jaringan dalam blok parafin terlebih dahulu dilakukan deparafinisasi menggunakan xylol dan ethanol, kemudian diperlakukan dengan proteinase K.(6)

PCR alela spesifik

Prosedur ASPCR merupakan modifikasi dari teknik semi nested PCR sebagaimana dilakukan oleh Peng (1999). Mula-mula dilakukan PCR menggunakan primer S1 dan A1. Kemudian produk dari PCR 1 tersebut direamplifikasi menggunakan nested primer S2 dan A2 atau S3 dan A2. Adapun urutan susunan primer dan posisinya adalah sebagai berikut : S1 5’ GGCGA CAGAG CGAGA TTCCA (13890-13909), A1 5’ GATTC TCTTC CTCTG TGCGC (145434-14515), S2 5’ TGGGC GGCAT GAAACGGAGT (14055-14074), S3 5’ TGGGC GGCAT GAAACGGAGG (14055-14074), A2 5’ GGGTC AGCGC CAAGC AGAGG (14175-14156). Produk amplifikasi kemudian dianalisa pada 2% gel agarose dan diamati dengan pengecatan ethidium bromide dan penyinaran UV.

HASIL : Bahan biopsi yang diteliti terdiri dari 13 orang penderita laki-laki dan 5 penderita wanita yang berumur antara 2 – 53 tahun.

a. Profil penderita Hepatitis B Kronik yang diperiksa

Tabel 1. Profil Penderita Hepatitis B Kronik yang diperiksa mutasi gen p53

Tabel 1

Tabel 1

b. Profil Penderita Hepatitis C Kronik yang diperiksa

Tabel 2. Profil Penderita Hepatitis C Kronik yang diperiksa mutasi gen P53

Tabel 2

Tabel 2

Dari tabel 1 dan 2 tampak mutasi gen p53 ditemukan pada penderita Hepatitis B kronik atau Hepatitis C Kronik dan tidak tampak hubungan antara tingkat derajat fibrosis dan nekrosis dengan adanya mutasi tersebut.

Mutasi kodon 249 p53 didapatkan pada 5 orang (27.78%) yang terdiri dari : 3 orang penderita Hepatitis B Kronik, 1 orang penderita Hepatitis C Kronik, 1 orang penderita dengan Hepatitis B dan C Kronik.

Dalam penelitian ini mutan gen p53 didapatkan pada 5 dari 18 sediaan biopsi nonkanker (27.78%) dan bila hanya dimasukkan penderita hepatitis kronik frekuensinya adalah (31.3%)

DISKUSI

Proses terjadinya KHP pada infeksi virus Hepatitis B ada tiga tingkat yaitu : Inisiasi, Promosi, dan Progresi.(7) Pada tahap Inisiasi terjadi integrasi antara genom virus Hepatitis B ke dalam genon hepatosit. Pada tahap Promosi mulai terjadi ekspansi klonal dari sel-sel yang telah terangsang dalam tahap inisiasi. Pada tahap Progresi sel-sel yang telah mengalami transformasi keganasan akan mengalami replikasi lebih lanjut. Pada penderita dengan hepatitis B kejadian KHP bisa langsung terjadi tanpa melalui proses sirosis, tetapi untuk hepatitis C selalu melalui proses sirosis.

Peran dari gen p53 yang merupakan ”Tumor Supressor Gene” dalam terjadinya KHP sangat penting baik dari pengaturan pertumbuhan sel dan proses apoptosis.(8) Infeksi virus hepatitis B dan C menghambat gen tersebut dan sering terjadi mutasi pada gen tersebut. Khusus pada KHP sering terjadi mutasi pada kodon 249 gen p53, hal ini diduga sebagai salah satu pemicu terjadinya KHP. Dengan terdeteksinya gen p53 pada penderita-penderita Hepatitis Kronik jauh sebelum timbulnya manifestasi KHP maka deteksi mutasi gen p53 dapat dipakai sebagai sarana diagnosa molekuler dini dari KHP, sehingga masih bisa dilakukan tindakan preventif untuk mencegah manifestasi KHP.

Penelitian menunjukkan bahwa terjadinya KHP sangat berkaitan dengan tingginya viral load. Semakin tinggi viral load kejadian KHP akan semakin meningkat.(9;10) Dengan positifnya mutan gen p53 maka bila viral load pada penderita masih tinggi perlu diberikan obat-obat antiviral yang efektif untuk menurunkan viral load serendah mungkin dan selama mungkin atau bahkan menghilangkan virus.

KESIMPULAN

Mutasi gen p53 dapat terjadi pada jaringan hati penderita-penderita penyakit hati kronik yang belum menunjukkan adanya tanda-tanda KHP. Cara ini membuka kemungkinan untuk diagnosa dini KHP dan sehingga memungkinkan intervensi dini untuk mencegah terjadinya KHP.

DAFTAR PUSTAKA

(1). Lab Vision Corp : P53 mutant (Data Sheet) : Cat # RP. 9332. PLABX 47790 Westinghouse Dr. Fremont CA 94539, USA

(2). Park Y.M, Yoo Y.D, Paik S.Y, Kim B.S, Tabor E. Mutation of tumour suppression gene p53 in hepatocellular carcinomas from Korea. Experimental and molecular medicine, 1996; 28 (4) : 173-9

(3). Xiao-Mou P, Chun-Lan Y, Xue-Juan C, Wen-Wei P, Zhi-Liang G. Codon 249 mutation of gene p 53 gene in non neoplastic tissues WJG 1999;5:324-326

(4). Bedossa P., Poynard T. For the METAVIR Cooperative study Group. An Algorithm for the Grading of Activity in Chronic Hepatitis C. Hepatology 1996;24:289-293

(5). Onata M. Treatment of Chronic Hepatitis B Infection. NEJM 1998;339-141-115

(6). Peng X.M, Yao C.L, Chen X.J, et al. Codon 249 mutations of p53 gene in non-neoplasticliver tissues. World J of gastroenterology, 1999; 5(4):324-326

(7). Soewignjo S, Gunawan S. Hepatitis B Virus dan Karsinoma Hepatoseluler. Hepatitis Virus B. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC, 1999:86-87

(8). Tao C., John M.L., et al. Evaluation of Quantitative PCR and Branchedchain DNA in Sera From Hepatocellular Carcinoma and Liver Transplant Patients. J Clin Microbiol, 2000; 38 (5) : 1977-1980

(9). Chen C.J., Yang H, You S.H. HBeAg antigen and the risk hepatocellular carcinoma. The New England Journal of Medicine 2002;347:1721-1722

(10). Chen C.J., Yang H, Su J., Jen C.L, You S.L., Lu S.N., Huang G.T., Iloeje U.H. Risk of Hepatocellular Carcinoma Across a Biological Gradient of Serum Hepatitis B Virus DNA Level. (Reprinted) JAMA, 2006; 295 (1):65-73

Prof. DR. Dr. Soewignjo Soemohardjo, Sp.PD-KGEH
Biomedical Clinic
Bung Karno street Num. 143
Mataram West Nusa Tenggara Indonesia
Email    : Soewignjo@gmail.com
https://biomedikamataram.wordpress.com

Social Bookmarking